产品货号：
LA10297
中文名称：
活死细胞染色检测试剂盒(Calcein/PI)
英文名称：
Calcein-AM/PI Double Staining Kit
产品规格：
1000T
发货周期：
1～3天
产品价格：
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本试剂盒通过同时检测细胞内酯酶活性和质膜完整性，提供一种判断细胞活力的荧光染色方法。
本试剂盒内含有两种染料：钙黄绿素-AM (Calcein-AM)和碘化丙啶(PI)，Calcein-AM可透过活细胞膜，通过活细胞内的酯酶作用由几乎无荧光的Calcein-AM脱去AM基团生成具有强烈荧光信号的绿色荧光物质Calcein(Ex/Em：495nm/515nm)，因此活细胞可被检测到绿色荧光。另一方面PI不能透过活细胞的细胞膜，但当细胞膜受损时PI可进入到细胞内并与核酸结合，产生明亮的红色荧光(Ex/Em：535nm/617nm)，因此死细胞会被检测到红色荧光。用490nm激发时可用荧光显微镜同时观察活细胞和死细胞；而用545nm激发时仅可观察到死细胞。
本试剂盒适用于荧光显微镜、流式细胞仪、荧光酶标仪等荧光检测系统。本试剂盒可以应用于大多数的真核哺乳动物细胞，但不适用于细菌和真菌。
| 组分 | 规格 |
| Calcein AM Solution (4mM in DMSO) | 100μL |
| PI Solution (16mM in DMSO) | 100μL |
| 说明书 | 1份 |
保存：-20℃，避光，有效期1年。
- 本试剂盒中的Calcein-AM Solution和PI Solution量很少，有可能会粘在盖子或管壁上，开封前请先适当离心至管底。
- 由于Calcein-AM储存液对湿度非常敏感，请在每次使用后紧紧密封Calcein-AM储存液的盖子。如果不能一次用完，建议根据单次用量分装密封保存。例如分装成10μL/管，用封口膜封口，并用铝箔纸包裹，放在一个密闭性能好的塑料袋中，并放入一包干燥剂，在-20℃密封避光保存。
- 染色工作液必须现配现用，配制好的工作液请在当天使用。
- 荧光染料均存在淬灭问题，保存和使用本试剂盒的过程中请尽量注意避光，以减缓荧光淬灭。建议染色后尽量当天完成检测。
- 碘化丙啶对人体有刺激性，操作时请小心，并注意适当防护以避免直接接触人体或吸入体内。
- 为了您的安全和健康，操作时请穿着实验服并佩戴一次性手套。
一、(可选)确定染色试剂的最佳浓度：
由于不同细胞种类、细胞浓度的染色条件不同，建议通过以下的操作自行摸索一下Calcein-AM和PI的最适浓度：
- 制备死细胞：细胞在0.1%皂苷或0.1～0.5%毛地黄皂苷中培养10min或在70%乙醇中培养30min。
- 用0.1～10μM PI工作液染死细胞，以便找到仅针对细胞核染色而不对细胞质染色的PI浓度。
- 用0.1～10μM Calcein-AM工作液染死细胞，以便找到不对细胞质染色的Calcein-AM浓度，再以此浓度的Calcein-AM对活细胞染色以检验活细胞是否能被染色。
二、染色工作液的配制(以2μM calcein AM,8μM PI为例)：
Calcein-AM和PI推荐浓度范围为0.1～10μM，可以根据步骤一确定的最佳浓度来配制工作液。一般来说，满足信号足够的前提下，尽可能选择最低浓度的染料剂量。
- 取出Calcein AM Solution和PI Solution，室温平衡30分钟。
- 在10mL的PBS中加入5μL的PI Solution和5μL的Calcein AM Solution，涡旋震荡混匀制成工作液，此时Calcein AM的浓度为2μM，PI的浓度为8μM。
- 所得到的的工作液(2μM钙黄素AM和8μM PI)可直接用于染色细胞。
三、染色步骤：
- 对于贴壁细胞：
- 可以将细胞接种至细胞培养板、微孔板或者制作成细胞爬片。悬浮细胞也可制作成细胞爬片。
- 按照实验要求处理细胞后，用PBS温和洗涤细胞2～3次，确保除去培养基中含有的活性酯酶。
- 加入足量的染色工作液，保证没过单层细胞。
- 在37℃孵育15～30分钟。
- 可以将细胞接种至细胞培养板、微孔板或者制作成细胞爬片。悬浮细胞也可制作成细胞爬片。
- 对于悬浮细胞：
- 按照实验要求处理细胞后，1000rpm，3min离心收集细胞(104-105 cells)。
- 去除上清，PBS重悬洗涤2～3次，确保除去培养基中含有的活性酯酶。
- 用100μL染色工作液重悬细胞，使细胞密度大约为105-106 cells/ml。
- 在37℃孵育15～30分钟。
- 按照实验要求处理细胞后，1000rpm，3min离心收集细胞(104-105 cells)。
四、荧光检测和分析：
- 荧光显微镜检测：
- 对于贴壁细胞：对于培养板孔中的细胞：吸出染色工作液终止孵育，加入10μL PBS，覆以干净的盖玻片。
对于细胞爬片：在干净的载玻片上滴加10μL的PBS，覆以细胞爬片。可以以指甲油密封，防止水份蒸发。
对于悬浮细胞：在干净的载玻片上滴加适量的染色的细胞溶液，覆以盖玻片。可以以指甲油密封，防止水份蒸发。 - 在荧光显微镜下使用490±10nm激发波长下同时观察活细胞(黄绿色荧光)和死细胞(红色荧光)。另外使用545nm激发波长单独观察死细胞。
- 对于贴壁细胞：对于培养板孔中的细胞：吸出染色工作液终止孵育，加入10μL PBS，覆以干净的盖玻片。
- 荧光酶标仪检测：
- 按照实验要求准备对照样本，与实验组样本一起按照步骤二、三操作。对照样品可以有：无细胞对照(G、H)，活细胞对照(E、F)和死细胞对照(C、D)。死细胞对照可以按照步骤一方法制备。如果测量死活细胞的相对增量，那么对照可以不用设置。
样品编号 样品名称(细胞种类) 检测发射波长 染色液 测得结果 A 实验组细胞样品 645nm Calcein AM/PI F(645)sam B 实验组细胞样品 530nm Calcein AM/PI F(530)sam C 死细胞对照样品 645nm PI F(645)max D 死细胞对照样品 645nm Calcein AM F(645)min E 活细胞对照样品 530nm PI F(530)min F 活细胞对照样品 530nm Calcein AM F(530)max G 无细胞样品 530nm Calcein AM/PI F(530)0 H 无细胞样品 645nm Calcein AM/PI F(645)0 - 贴壁细胞可直接检测。悬浮细胞：将染色好的细胞悬液以每孔100μL加入至微孔板各孔。
注：每孔细胞最低检测值大约为200～500个，每孔最大常用细胞测值约为106个。 - 使用荧光酶标仪以合适的激发和发射滤光片收集样本数据。为了获得最佳的灵敏度，所使用的酶标仪，建议采用带光学过滤器的信号激发器，可保证不互相干扰。Calcein可以用(490±10nm)的荧光光学滤光器激发，而PI可以用(530±12.5nm)的典型罗丹明光学滤光器来兼容。而发射光信号可以通过滤光器得到很好的分开采集，Calcein是530±12.5nm，PI是645±20nm。
- 结果分析与计算：
死细胞的特点是在645nm下有强荧光信号，而530nm处有弱荧光信号。在计算结果之前，可以分别从F(530)和F(645)的所有值中减去背景荧光读数F(530)0和F(645)0。活死细胞的百分比可以定义为荧光读数的计算：
Live Cells% =(F(530)sam - F(530)min)/(F(530)max - F(530)min)
Dead Cells% =(F(645)sam - F(645)min)/(F(645)max - F(645)min)
绝对活死细胞数量的计算：制作细胞数与荧光读数(530nm和645nm)的标准曲线，荧光强度与样本中的细胞数成线性正相关。
- 按照实验要求准备对照样本，与实验组样本一起按照步骤二、三操作。对照样品可以有：无细胞对照(G、H)，活细胞对照(E、F)和死细胞对照(C、D)。死细胞对照可以按照步骤一方法制备。如果测量死活细胞的相对增量，那么对照可以不用设置。
- 流式细胞仪分析：
悬浮细胞或经胰酶消化的贴壁细胞，可以类同步骤二、三的悬浮细胞染色操作。染色后的细胞悬液可直接上机检测。
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